Wiązanie z białkami

Wiązanie z białkami osocza

Aby zrozumieć potencjał dystrybucyjny badanego związku oblicza się jaka część związku znajduje się w osoczu w formie niezwiązanej. Określa się to za pomocą dializy równowagowej. Miara wiązania do białek osocza związana jest z dystrybucją związku do tkanek w ciele. Wysoka wartość współczynnika wiązania do białek osocza potencjalnego leku, może spowodować wolniejszy metabolizm i eliminację. Dializa równowagowa jest najszerzej akceptowalną metodą określania wiązania badanych molekuł do białek osocza, ze względu na zminimalizowany (w porównaniu do innych metod np. ultrafiltracji) efekt wiązania niespecyficznego.

 

Standardowy protokół badania wiązania białek osocza:

Metoda Dializa równowagowa
(przy 10 %, 50 % lub 100 % osoczu)
Stężenie badanego związku 5 μM (dostępne różne stężenia)
Liczba powtórzeń 2
Ilość potrzebnego związku 150 μL, 10 mM roztworu
Metoda analityczna LC-MS/MS ilościowo (w osoczu
i  buforze standardowym)
Dane wynikowe Ułamek niezwiązanego leku w 100% osoczu
Odzysk

Wiązanie z białkami krwi

Wiązanie z białkami krwi ma duży wpływ na farmakodynamikę badanych związków, ponieważ jedynie niezwiązana frakcja może oddziaływać z receptorami i wywoływać efekt farmakologiczny. Częściej określa się stężenie leku w osoczu niż w pełnej krwi. Jednak dla prawidłowej interpretacji wyników wskazane jest przeprowadzenie badań wiązania do specyficznych komponentów krwi.

 

Standardowy protokół badania wiązania do białek krwi:

Metoda badania

Rapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)

(8K MWCO, podział: 100% krew-bufor)

Dostępne gatunki Człowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku 5 µM
Czas inkubacji 4 godz.
Temperatura 37oC
Kontrole Próba ślepa
Kontrola dodatnia (2 związki: Metoprolol; Chlortalidon)
Liczba powtórzeń

3 próby dla badanego związku

1 próba dla kontroli

Metoda analityczna LC-MS
Dane wynikowe Ułamek niezwiązanego leku w krwi
Odzysk

Wiązanie z tkanką mózgową

Skład tkanki i osocza jest bardzo różny. W danej objętości osocza znajduje się dwa razy więcej białek, a w mózgu 20 razy więcej lipidów.

 

Standardowy protokół badania wiązania do tkanki mózgu:

Metoda badania

Rapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)

(8K MWCO, podział: 100% homogenat tkanki mózgu-bufor)

Dostępne gatunki Człowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku 5 µM
Czas inkubacji 4 godz.
Temperatura 37oC
Kontrole Próba ślepa
Kontrola dodatnia (2 związki: zależne od wyboru gatunku)
Liczba powtórzeń

3 próby dla badanego związku

1 próba dla kontroli

Metoda analityczna LC-MS
Dane wynikowe Ułamek niezwiązanego leku 100% homogenacie tkanki mózguOdzysk

Wiązanie z mikrosomami

Zostało udowodnione, że wpływ na kinetykę metabolizmu w testach in vitro może mieć niespecyficzne wiązanie liposomalne, powodując problemy z dokładnym określeniem klirensu. Szereg przykładów dowodzi, że znajomość wiązania mikrosomalnego pozwala dokładniej zrozumieć zależności pomiędzy metabolizmem in vitro i farmakokinetyką in vivo.

 

Standardowy protokół badania wiązania mikrosomalnego:

Metoda badania

Rapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)

(8K MWCO, podział: 100% mikrosomy-bufor)

Dostępne gatunki Człowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku 5 µM
Czas inkubacji 4h
Temperatura 37oC
Kontrole Próba ślepa
kontrola dodatnia (2 związki: Atenolol, Propranolol)
Liczba powtórzeń

3 próby dla badanego związku

1 próba dla kontroli

Metoda analityczna LC-MS
Dane wynikowe

Ułamek niezwiązanego leku w mikrosomach

Odzysk

Podział pomiędzy krwią i osoczem

Podział pomiędzy krwią i osoczem obliczany jest z użyciem testów wiązania do białek osocza i białek krwi.